鱼蛋白生产线酶法

酶法提取是指可溶性胶原和酸溶性胶原被提取后，需用一些蛋白酶，如胶原酶、*、木瓜蛋白酶和

盐析后胶原蛋白电泳图谱

*等水解，得到不同的酶促溶性胶原蛋白。所使用的蛋白酶主要分3种：动物蛋白酶（如*，*），植物蛋白酶（如木瓜蛋白酶，*），微生物蛋白酶（如碱性蛋白酶，*）。在对酶法水解胶原蛋白的研究中，以碱性蛋白酶应用zui多。

将胶原进行限制性降解，即将末端肽切割下来，由于胶原肽链间的共价键都是通过分子末端肽里的赖氨酸或羟赖氨酸的相互 作用形成的，末端肽被切下后，含三螺旋结构的主体部分可溶于稀有机酸而被提取出来。用酶处理，可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽，提高胶原蛋白的产率；而且 还不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，保持其特性。影响酶提取的因素有很多，如酶浓度、酶与底物的比例、酶解时间、酶解温度、pH值以及料液比等。在实际操 作中，大多数采用酶复合法提取胶原蛋白，较多的是使用*提取，有机酸多为乙酸。

酶解胶原蛋白的工艺主要分为单酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分为混合酶水解法（比如牛*，链霉菌蛋白酶，芽孢杆菌蛋白酶混合）和分步酶水解

*提取胶原蛋白的电泳图谱法， 酶法提取皮胶原具体实验工艺及条件的选取通常应考虑要开发的产品对分子量的要求，要得到分子量较小的胶原多肽一般采用多酶水解法。影响酶解效果的因素主要 有：酶的种类、加酶量、酶解温度、酶解时间、pH值及料水比。采用酶法提取骨料中的胶原蛋白，既能有效缩短提取时间，又能获得具有良好生物活性的胶原蛋 白，而且对环境的污染也较小。胶原蛋白不易被普通蛋白酶水解，但能被动物胶原酶断裂，断裂的碎片自动变性后可被普通蛋白酶水解。*水解胶原蛋白的适 宜条件为pH 1.65～1.70、温度37℃。

有人以猪骨为原料，用蛋白酶的酶解反应代替传统制胶工艺，对骨胶原的酶解反应与酶法制胶工艺进行了试验研究。结果表 明：以*对骨胶原的提取率zui高（46.14%），其次是*（43.42%），接下来是*（30.14%），zui后是碱性蛋白酶 （21.15%）。并且通过单因素和正交试验对*酶解反应中各主要影响因素进行了优化。试验结果表明，*提取的*条件是，*的浓度是 1%，在pH2.0的条件下酶解48h，然后在浓度为10%（w/v）的NaCL溶液中盐析24h，zui后骨胶原的回收率为64.77%，骨胶原的提取率为 49.75%。还有人用*提取猪皮胶原蛋白，分别在水解0、2、6、10、14、18、22、26h时对四种不同*用量（分别为1%、2%、 2.5%、3%）的试样取样检测，采用一阶HILL方程模拟*提取猪皮胶原蛋白的进程以及*水解速率的衰减过程，zui后得出2%的*用量 和6-7h的水解时间提取率zui大。还有人用以新鲜猪皮为原料，在50-52℃的条件下用*进行水解，在酶用量为 5000：1～10000：1，pH值为9，反应2－3h，原料：水为1：2的条件下酶解。结果表明：总蛋白质的提取率≥80%。

鱼蛋白生产线采用酶法提取胶原蛋白时，必须严格控制提取条件。首先，酶作用时间必须适当。如果时间过短，胶原蛋白，就不能充分释放到提取液中，影响提取率；如果酶作用时间过长，胶原蛋白会水解过度，产生过多的苦味小分子低聚肽，不仅会增加分离纯化的难度，也会影响胶原 蛋白的功能特性和生物活性。其次，酶解温度要适宜。温度过低，酶的作用效果不明显；温度过高会引起酶的失活和胶原蛋白的变性。据报道，当介质pH略低于中 性时，胶原蛋白的变性温度为40～41℃，当介质pH为酸性时，胶原蛋白的变性温度为38～39℃，而且鱼皮胶原蛋白的变性温度要比猪皮胶原蛋白的变性温 度低7～12℃。所以，如果要使提取的胶原蛋白具有良好的生物活性，在提取过程中应使提取温度低于变性温度。第三，需选用适当的酶。一般从陆生哺乳动物组 织中提取胶原蛋白时，采用*在其zui适作用温度下进行提取是合理的，但对于鱼类等水生动物，由于其胶原蛋白的变性温度比陆生哺乳动物低，因此许多蛋白 酶便不适用，如果在这些酶的zui适作用温度下提取可能会破坏胶原蛋白的某些功能特性和生物活性。采用酶法提取胶原蛋白及其多肽的研究主要是从动物皮及其加工 副产物中，应用酶法从动物骨中提取胶原蛋白及其多肽报道较少。

纯化

可用于胶原蛋白的纯化方法包括盐析法、透析法、离心法、电泳法和色谱法，其中盐析法、离心法和电泳法zui为常用。由于单一方法难以*分离纯化胶原蛋白，实际 操作都是通过复合法来达到分离纯化胶原蛋白的目的。盐析法一般采用高浓度NaCl；离心法常选用制备型低温超速离心机；电泳法多采用十二烷基硫酸钠聚丙烯 酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE），该法既可用于胶原蛋白的分离纯化，还可用来测定胶原蛋白分子的相对分子质量。像有人用破碎、酶解、盐析三步法提纯苏 尼特羊骨骼I型胶原蛋白。先去除骨头里的非胶原物质，然后往沉淀中10%的*，在4℃的条件下消化24h，以14000r/min离心40min。 弃沉淀往上清液中加NaCL，使它终浓度达到0.9moL/L，静止过夜，再离心，zui后的沉淀就是I型胶原蛋白。

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