Phos-tag™ SDS-PAGE凝胶制胶方法2——凝胶制备

视频简介

Phos-tag™ Acrylamide新品速递图wako.jpg

SDS-PAGE分离不同磷酸化水平的蛋白!

 

  在不使用放射性同位素的情况下,利用Phos-tag™ SDS-PAGE即可分离不同条带中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分离后的凝胶可用于Western blotting和质谱分析等后续实验。

  Phos-tag™ SDS-PAGE操作简单,只需在常规SDS-PAGE胶中加入Phos-tag™ Acrylamide 和Mn2+或者Zn2+即可进行实验。在电泳过程中,磷酸化蛋白的磷酸基团与Phos-tag™中的二价金属离子相结合,降低其迁移速度,从而可区分磷酸化与非磷酸化蛋白。

 

原理

phos-tag原理

优点、特色

●  采用Phos-tag™ SDS-PAGE可轻松分离磷酸化蛋白

   无任何放射性元素及化学标记!

  可检测不同磷酸化水平的磷酸化蛋白

   无需任何磷酸化抗体!

  适用于内源性蛋白的磷酸化分析!

 

案例、应用

 

 

【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比较】

 

我*使用Phos-tag ™ ——东京大学研究院医学研究科 小川觉之

 

  Phos-tag ™ 是专为研究磷酸化蛋白而新开发出来的试剂。此产品使用方便,不但可用于体外实验,还能定量分析体内蛋白的磷酸化水平。Phos-tag ™ SDS-PAGE 可用于常规电泳实验,无需购买特殊设备,性价比高。传统蛋白磷酸化的研究需要特异的磷酸化抗体、RI 等其它试剂,操作复杂,花费大,且放射性元素会有安全隐患,而Phos-tag ™ 的出现恰恰可以弥补这些缺点,为磷酸化蛋白研究提供新的方向。

 

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分离效果图

 

03.jpg

 

  Lane 1 为非磷酸化蛋白,Lane 2-5 为磷酸化蛋白,各蛋白因磷酸化状态不同而条带迁移率也有所不同。

  磷酸化/ 非磷酸化蛋白的数量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的丰度等都可根据条带迁移和条带浓度求得。

 

【资料提供】

日本东京大学研究生院医学系研究科

 

【二维电泳中的应用:分析hnRNP K 磷酸化异构体】

 

  小鼠巨噬细胞J774.1 经LPS 刺激后,裂解细胞,经过免疫沉淀法分离得到hnRNP K。在二维电泳中,一维是IPG 胶,二维是Phos-tag ™ SDS-PAGE,可分离hnRNP K 的异构体。利用质谱仪,可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。

 

二维电泳

 

04.jpg

 

  同一个等电点的位置上,不同位点发生磷酸化都可以被区分开来(例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7)

 

【参考文献】

Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics , Nov 2010; 10(21): 3884-95.

 

【结果提供】

  横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生(Dr. Y. Kimura)、平野久(Dr. H. Hirano)理化学研究所RCAI 小原收

 

【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的变化】

 

  常规SDS-PAGE 和Phos-tagTM SDS-PAGE 后迚行克疫印迹实验分析EGF 刺激的A431 细胞中MAPK 磷酸化水平。

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  摘自Kinoshita-Kikuta, E. et al., Mol.Cell. Proteomics. (2007)6: 356.

 

◆产品列表

产品编号 产品名称 规格 包装
304-93526

Phos-tag Acrylamide AAL-107

5mM Aqueous Solution Phos-tag 丙烯酰胺5mM水溶液

蛋白研究 0.3 mL
300-93523

Phos-tag Acrylamide AAL-107

Phos-tag 丙烯酰胺

蛋白研究 2 mg
304-93521

Phos-tag Acrylamide AAL-107

Phos-tag 丙烯酰胺

蛋白研究 10 mg
134-15302 Manganese(II) Chloride Tetrahydrate氯化锰四水合物 for Molecular Biology 25 g

 

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