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减少pcr产物中引物二聚体的方法

来源:上海研生生化试剂有限公司2024/9/28 7:25:1712
导读:

 减少引物二聚体的方法

1. 从引物自身着手,重新设计引物,这是zui根本解决这一问题的办法。
2. 可能模板有问题。
3. 模板浓度过小,适当加大模板量。
4. Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度。
5. 取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的。
6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增强特异性。
7. PCR反应体系的配制在冰上进行,zui后加TAq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
8. 增加循环数。
9. 降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些)。
10. 若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在 20-25 mmol/l 没有区别,则考虑Buffer等试剂没有*融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。
11. 以上次的pcr产物作模板二次pcr,可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,如果间隔较长可以稀释50-100倍。
 
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