Sanger酶法DNA序列分析
一、试剂
1 、 10 × TBE ( pH 8.3 )：
2 、 46% 尿素溶液：
3 、 20% 聚丙烯酰胺溶液
4 、 10% 过硫酸胺
5 、引物
6 、模板
7 、 DNA 聚合酶
8 、放射性标记的 dNTP 和 ddNTP 贮存液
9、TEMED
二、操作方法
(一)由双链质粒制备单链DNA膜板
取质粒 DNA (溶于双离蒸去离子水中) 8μl ( 1.5 ～ 2ug )
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加 2mol NaOH 2ul ，混匀后稍加离心，置室温 10min
↓
加 3mol 乙酸钠( pH5.2 ) 3μl
双蒸去离子水 7μl
无水乙醇 60μl
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置液氮 10min ，离心 10min ( 13krpm )，
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加 70%乙醇洗1次，离心 ( 13krpm )
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弃上清，真空抽干，溶于 10ul双 蒸去离子水中
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取样，电泳鉴定
(二)聚丙烯酰胺/尿素胶制备：
将玻板洗净，拭干; 70% 乙醇洗，凉干;内层涂硅油，
重蒸水洗净，吹干
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混合： 20% 聚丙烯酰胺液 20ml
10 × TBE 5ml
46%尿素 25ml
总计40ml过滤纸滤过
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加 10%过硫酸胺(AP)250μl;用双蒸去离子水定容至100ml，混匀
↓
倒胶前加入 TEMED 50μl，混匀
↓
灌胶，待凝胶聚合后，将测序胶板安装于测序电泳槽中
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电泳槽中加入 800ml1 × TBE
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预电泳
(三)DNA序列反应：
模板 DNA 10μl ; 4 只离心管上标记
引物 2μl G 、 A 、 T 、 G 各管中
退火缓冲液 2μl 分别加入 2.5ul 的 ddNTP
总体积 14μl 终止混合液，盖好盖子。
↓ ↓
60℃ 10min 变性 37℃孵育1min
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标记混合物 3μl
α-32P-dATP 1μl
稀释的DNA聚合酶2μl
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混匀后置室温5min
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每个反应管4.5μl ↓
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37℃ 5min温浴
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每管加入5μl 终止液
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混匀，置冰上
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上样前75～80℃
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混匀，置冰上
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上样前75℃～85℃加热2min，随即上样
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依次为A、G、C、T，每孔上样2～3μl
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40W恒功率下电泳，至溴酚蓝走到底
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