慢病毒的浓缩与纯化
方法一 超速离心沉淀法
1. 取6个Ultra-clear SW28离心管,用70%乙醇消毒后,放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟.
2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液.
3. 取一支10ml的移液管,吸取12 ml 20%的蔗糖溶液.将移液管一直插入到离心管的底部,缓慢将蔗糖溶液打出4 ml.同样地,将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中.另取一支干净的移液管,对剩下3管进行同样处理.
4. 用PBS调整各管的重量,使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g.
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中.
6. 4℃,25,000 rpm. （82,700g） 离心2小时.
7. 小心将管子从转头中取出.倒掉上清,将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干.吸掉剩余的液滴.在管底应当有可见的沉淀.
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀.
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中,盖上盖子.
10. 在4℃溶解2小时,每隔20分钟轻轻震荡.
11. 4℃,500g离心1分钟,使溶液集中于管底.
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬.避免产生泡沫.将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中.
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份,保存在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80 ℃.
方法二 PEG-8000浓缩法
1. 5X PEG8000+NaCl配制 称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃.
2. 使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；
3. 每30ml过滤后的病毒初始液,加入5X PEG-8000+NaCl母液7.5 ml；
4. 每20～30min混合一次,共进行3-5次；
5. 4度放置过夜；
6. 4度,4000 g,离心 20min；
7. 吸弃上清,静置管子1～2分钟,吸走残余液体；
8. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
9. 集中后的病毒悬液分装成50 μl每份,保存在成品管中.用碎干冰速冻后储存在-80 ℃
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