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T细胞尼龙毛分离法利用了尼龙毛对B细胞的亲和力，从而使T细胞在没有严重损伤的情况下达到的足够的纯度。因为这个方法不像流式和磁珠费用昂贵，而且操作简便，所需要的条件也不高，是一种非常实用的方法。 　

　(在此我向各位解释一下，现在分离T细胞的方法主要是三种，流式，磁珠法，尼龙毛法。与前两种方法相比，尼龙毛法的优势在于无需特定的设备仪器，一般的实验室均有条件操作；价格相对低廉；可以进行大量样本操作。) 　

　首先要指出的是实验中所使用的是分离T细胞的尼龙毛(Nylon Fiber)，不是化工上的尼龙纤维，曾经有人问过我这种问题，如果你买错了，可是做不出来的！

其次，现在市面上的尼龙毛也是良隽不齐，也有同仁反应买到的尼龙毛加入缓冲液以后成了一团糨糊，根本没法使用，这个问题就要靠各位的慧眼了。 　　
现在市面上有尼龙毛填料，也已经有了商品化的尼龙毛柱子，这两者的区别主要是以下两点： 　　

1. 商品化的柱子的填料量是已经定好的，有一个确定的上样量范围。而自己买填料装柱可以控制填料量，也就是可以控制上样量，这对于样本量非常少，或是样本量非常大的实验需求非常合适。 　

　2. 商品化的柱子已经经过了无菌处理(一般是辐射灭菌)，而自己装柱当然就要自己灭菌了。 　　

3. 商品化的柱子在实验的重复性上有着的优势。自己装的柱子在填料的处理和装柱的松紧等方面不容易控制，差异性的控制就看你的实验技巧了。 　　

操作方法： 　　
1.秤取1.5g尼龙毛装入20-30ml玻璃或一次性注射器内(要可以灭菌的)，填料的体积控制在15毫升左右(注射器上有标记，所以还是比较好控制的)，因为尼龙毛的松紧关系到T细胞的回收率，

所以要特别注意。注射器下端配接5厘米左右长的带有弹簧夹的橡皮管。 　

2. 加入大量的PBS平衡柱子后，用铝箔包裹，并置于适当的容器内，高压灭菌15分钟。 （商品化尼龙毛柱以上步骤可以省略，经过无菌PBS平衡后直接进行下列步骤。） 　

3. 灭菌的尼龙毛柱垂直固定后放于超净台内，顶部以铝箔覆盖，避免污染。 　

4. 橡皮管，弹簧夹用wu水酒精消毒后接注射器下端，打开弹簧夹调节流速在大约3-4ml/min。 　　

5.首先，加入3-4倍柱体的无血培养基平衡；随后，之后加入相同体积的含有血清的培养基平衡（上述培养基都要预热），后等培养基页面接近柱填料页面时，关闭弹簧夹。 　

6. 样本细胞悬浮液浓度控制在5×108cells/ml的，上样量一般是1/3-1/5柱体积(商品化的柱子一般都有*上样量)。样品加入之后，再加入少量培养液，然后关闭弹簧夹。 　

7. 柱上覆盖铝箔，移置于消毒过的容器中，37℃孵育1小时。此过程中柱子必须要保持垂直状态。 　　

8. 从培养箱中拿出柱子，置于超净台内，除去铝箔。接上按照4.中的方法消毒的弹簧夹和橡皮管，加入适当体积经37℃预热的培养基，打开弹簧夹控制流速在3-4 mL/min，流出约5ml之后，流出的培养液基变得不透明，此时其中含有T细胞，收集这一部分培养基。

9. 基本上何时结束收集取决于流出液体中细胞的浓度，实际上，收集的量达到一个柱体积时就可以停止收集，因为即使收集更多的量，回收率几乎不会增加。 　

10 。参考数据： 　　样本：小鼠脾脏（T细胞含量在30-40%，B细胞含量在55-60%） 　　细胞回收率：13-25% 　　B细胞污染率：小于15% 　　

　样本：大鼠脾脏（T细胞含量在30-35%，B细胞含量在55-65%） 　　细胞回收率：大于25% 　　B细胞污染率：小于15% 　　 　　

样本：人或兔外周血 　　细胞回收率 : 20-30% (人)；25-35% (兔) 　　B细胞污染率：小于5% (人、兔) 　　 　

　（注）收集粘附于尼龙毛上的细胞时，将T细胞收集完毕后的尼龙毛在无菌操作的状态下取出，转移到适当的容器中，用镊子小心的将尼龙毛松开，粘附的细胞可以洗到培养基中。

或者将注射器芯插入注射器内，通过压力使的粘附的细胞随着液体流出。 　　 　　

产品信息 　　品牌 品名 规格 　　Wako T细胞尼龙毛柱 0.5g*10 (*用于小鼠脾脏) 　　Wako T细胞尼龙毛柱L型 1g*10 (*用于大鼠脾脏、人或兔子的外周血) 　

　Wako T细胞尼龙毛 2g*5 (可按照自己的需要装柱，控制上样量) 　　Wako 小鼠淋巴细胞分离试剂 30mL*5 用于从小鼠脾脏，淋巴结，淋巴结悬浮液中分离淋巴细胞 　

　Wako 人淋巴细胞分离试剂 100ml*6 用于从人血中提取淋巴细胞 　　Wako 铁粉(羰ji铁)Iron Powder, from Iron Carbonyl 25g 直径25um，用于清除巨噬细胞 　　Wako κ-卡拉胶κ-Carrageenan 25g