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色谱又称色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用不同溶质(样品)与固定相和流动相之间的作用力(分配、吸附、离子交换等)的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。

01柱色谱

为向玻璃管中填入固定相，以流动相溶剂浸润后在上方倒入待分离的溶液，再滴加流动相，因为待分离物质对固定相的吸附力不同，吸附力大的固着不动或移动缓慢，吸附力小的被流动相溶剂洗下来随流动相向下流动，从而实现分离。

02纸色谱

以滤纸条为固定相，在纸条上点上待分离的混合溶液的样点，将纸条下端浸入流动相溶剂中悬挂，溶剂因为毛细作用沿滤纸条上升，样点中的溶质从而被分离。

03薄层色谱
 

是在玻璃板上涂以固定相涂层，然后点样，下端浸入溶剂，同样自下而上分离。常用于探索柱色谱实验条件，溶剂和固定相的选择等。

常用固定相有石膏、氧化铝、蔗糖、淀粉等，常用流动相为水、苯等各种有机溶剂。

影响色谱柱使用寿命的主要因素
　　

流动相因素

1.流动相pH
 

不同基质的填料具有不同的pH适用范围。常温下无定形硅胶在纯水中的溶解度约为100mg·L-1，且在pH1～9的范围内溶解的硅胶量几乎是常量，考虑到溶解速度的影响,对于硅胶基质的填料,其所能承受的流动相pH范围约为1～8。

键合相硅胶填料则由于键合层的屏蔽作用,使填料对流动相的适应范围大大增加，如现在广泛使用的反相色谱填料C18(十八烷基硅烷键合硅胶)，其pH适用范围可达2～10。当流动相pH值超出酸性范围时，键合相易发生水解而流失；当流动相pH超出碱性范围时，会加速硅胶的溶解而释放出絮状物堵塞柱子，这两种反应均是不可逆反应，特别是在温度较高（>40℃）的环境下，会使柱效迅速降低而报废。

2.流动相变质

当前使用的是硅基键合相填料，当以水溶液作为流动相或流动相中含有一定浓度的磷酸盐缓冲液时，水溶液中或缓冲盐溶液中会滋生出一些细菌或霉菌，从而堵塞固定相颗粒间的空隙。特别是对于多元自动比例混合的液相色谱仪来说,水相或缓冲盐相独立存贮，因存放时间较长而容易发生此类问题。

3.流动相纯度

目前，广泛使用的填料颗粒粒径范围在3～10μm,孔径在6～10nm,色谱柱在使用中会有大量的流动相通过,如流动相含有微量不溶性杂质颗粒,则很容易在柱头部位被截留,久而久之,造成色谱柱机械性堵塞,引起柱压升高而无法正常使用。

4.其它因素

如，流动相的极性对柱子也有一定影响，甲醇、水、冰醋酸等极性较大的物质会破坏硅胶填料柱，正丁醇、二氯甲烷等极性小的物质会破坏化学键合硅胶柱，碱性溶液会破坏阳离子交换树脂色谱柱,酸性溶液容易损坏阴离子交换树脂柱。

样品因素

1.样品的溶解性

样品试样在配制中，如有少量微粒未能*溶解，则会随试样一起进入色谱柱，同样，会沉积在柱头处，造成色谱柱的堵塞。

2.样品的纯度
 

样品中可能含有待分析组分以外的各种组分或杂质，这些组分或杂质可能会在柱内产生不可逆吸附，从而，使固定相的活性点被覆盖，保留特性发生变化。

3.样品的化学性质

待测试样中的各种组分与填料之间应具有化学稳定性，比较典型的是在使用氨基键合柱时，应避免使用含羰基的化合物和流动相，如，丙酮、乙酸乙酯等，以免固定相中的NH2和酐、酮发发希夫(Schiff)缩合而使固定相破坏。

其它因素

影响色谱柱寿命的因素很多，除流动相和样品因素外，还有其它一些外在因素，如，柱压的影响，温度的影响，色谱柱的正确冲洗，色谱柱的正确安装等。

色谱柱出现问题的解决办法

色谱柱在使用中zui常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），以下列举了部分常见原因及解决办法：

1.色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染。

解决方法：如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。

2.色谱柱头的填料被样品污染。

解决方法：如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。

3.色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出。

解决方法：如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。

4.流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。

解决方法：如果因pH值使用不当，很难恢复。

色谱柱的八大注意事项

1.避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此，在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓。

2.应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。

3.一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

4.选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。

5.经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右。

6.保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。

7.色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1～2mm高度(注意把被污染填料取净)再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相(与柱内相同)填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱(5～30mm)，可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH=2～9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。

8.新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如，ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素(氟、氯、溴)的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜*与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4～5天开机冲洗15分钟。

色谱柱不使用时应该怎样保存？

如果色谱柱不使用，又该如何进行保存呢？下列方法可供参考：

在柱二端包起来，放到盒子里室温避光保存。毛细管柱可以用废旧的隔垫裁成二块，分别插在毛细管二段。填充柱用小塑料袋套住，再用细金属丝扎起来。因为分析室有许多化学试剂，特别在橱内会有些气味，这样能较好保管色谱柱。放置时也要有序放置，毛细管柱还是用盒子装好以免压坏，在放置时在柱上和记录本上都做好记录。

拆下后，两头用橡胶垫密封，橡胶垫原本色谱盒子就带有，如果没有，用进样垫制作一下就可以了，然后装在原来的色谱盒子里面，备注上相应的信息。通常要求放在干燥的地方，下次使用时，切记进样端和出口端不能装反。

液相色谱柱的正确使用

1.加装保护柱

保护柱的作用是过滤掉来自流动相和样品的化学“拉圾”同时也可以有效除去流动相和样品中的不溶物。尽管现在的色谱仪在流动相吸入口、进样阀后部以及在色谱柱的两端都装有1、2μm等不同孔径的滤器,但滤器只能除去不溶性颗粒而不能除去化学污然,因此,加装保护柱是必要的,特别是在分析中药、中成药等复杂混合物和生物样品时更是保护分析柱*的措施。

保护柱填料应与分析柱一致,粒径可较分析柱大。保护柱属消耗品,经过一定次数的样品分析(50～100次)后,出现柱压显著升高或峰形变坏或基线漂移时,应考虑更换保护柱。

2.过滤流动相和样品

流动相通常由水或缓冲溶液与有机溶剂混合而成,原则上,所有经过色谱柱的流动相均应过滤,但在实际操作上应视具体情况而有所区别:当有机溶剂用色谱纯级,水用石英亚沸水或其它超纯水时,在能确保水和有机溶剂的质量且没有受到污染时,过滤并无更多实际意义。

当流动相中含有缓冲盐时,则过滤是必要的,如前所述,当缓冲溶液放置一段时间(视环境温度不同而异,夏季一般不超过48h,冬季一般不超过一周)后,在使用前还应重新过滤。

所配制的样品试液在注入流路系统前均要经0.45μm（0.22μm则更好)孔径滤膜过滤。要注意区分水系和油系,二者不可混用,以防止滤膜溶解而造成污染。装流动相的容器和色谱系统中的在线滤器要定期清洗和更换,以避免滤器因过载而起不到过滤作用。

3.净化样品

当样品中含有对色谱柱有损害的化学成分,如产生yongjiu性吸附的蛋白质、糖等有机分子和强吸附性物质,以及可能对柱填料产生破坏作用的基团离子。在进样前应尽可能对样品进行分离提纯以除去多余杂质组分。

4.避免过高的柱压

虽然液相色谱柱能耐受的压力可达6000psi(磅/平方英寸),但过高及过大的压力变化均会缩短色谱柱的寿命,避免的方法是：

(1)柱压过高时,尽可能采用较小的流速,以不超过柱zui大允许压力的一半为宜。

(2)当流速较大时,应采取流速梯度的办法使流速分步到位。

(3)使用手动进样阀时,进样阀的切换要尽可能的快。否则超过20%的压力冲击会很快使柱报废。当使用多柱联用时,柱切换要避免在高压下进行。

5.注意温度和酸碱度

一般以硅胶为基质的色谱柱zui高使用温度不超过60℃，以低于40℃为宜，特别是在流动相pH接近使用限度时，更应降低使用温度。温度过高会加快键合相的水解和硅胶的溶解，从而，使填料性质改变，柱床塌陷，降低柱效，改变峰形。目前的键合硅胶色谱柱标示的pH适用范围可达2～10,但在实际使用时应避免的pH条件,特别是在偏碱性的条件(pH≥8)下使用,如必须要在的pH条件下使用时,可通过以下方法避免柱损害：

（1）在泵和进样阀之间加装预柱(饱和柱)来饱和流动相；

（2）降低使用温度；

（3）检验完毕后立即用与所使用的流动相互相混溶的“温和溶剂”*清洗；

6.正确及时的冲洗

开始试验前,应了解柱中当前是何种溶剂。对于新色谱柱,如无特殊说明均为评价报告中所用流动相。柱中当前溶剂一定要与分析样品所用流动相互溶,如不能混溶,要用与二者均能相互混溶的第三种溶剂过渡。异丙醇是能与各种溶剂混溶的试剂,可作为中介流动相使用。

反相键合硅胶柱适宜的保存环境是纯甲醇,如分析用流动相为缓冲液有机溶剂,可先用较低甲醇含量(<20%)的甲醇置换掉原来的纯甲醇,再进分析用流动相，以防止在柱内发生盐的沉淀；试验结束后,要及时用适当的溶剂冲洗系统并zui终过渡到纯甲醇冲洗,对于含有缓冲盐的流动相，的办法是先用与分析用流动相组成*相同但不含缓冲盐的溶液进行冲洗，再逐步过渡到纯甲醇冲洗。

多数冲洗液体积大约为柱容积的15～20倍,但zui终要以基线是否平直、压力是否稳定决定。有些厂家的色谱柱标明了流动相中有机相的zui低使用浓度为≥5%,使用时应给予注意。