由于三维超景深显微镜的工作距离十分的小，所以大家在使用油镜的时候一定小心，以防在操作中损坏物镜上的透镜以及样本玻片。
使用的过程通常都是遵循从低倍镜开始、再到高倍镜，到油镜的过程进行操作的。如果本身就是使用的高倍镜，那么就没有必要再转换成低倍镜重新开始了，只需直接转换成油镜即可。
如果所使用的显微镜本身是带有止降功能的，那么在使用时，将香柏油滴加一滴至所观察的载玻片上，将油镜下移至油滴中，直到停止下降为止，之后再使用微调进行细微的调节直至清晰的物像；而如果所使用的显微镜是没有自动止降功能，那么载玻片上滴加过香柏油之后，下移物镜时就应该从侧面进行观看，将物镜下移至稍微与载玻片接触，之后再进行向上微调，直至调准焦点。
三维超景深显微镜的工作原理：
1.折射和折射率：
光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。当与透明物面不垂直的光线由空气射入透明物体(如玻璃)时，光线在其介面改变了方向，并和法线构成折射角。
2.透镜的性能：
透镜是组成三维超景深显微镜光学系统的基本的光学元件，物镜目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。依其外形的不同，可分为凸透镜(正透镜)和凹透镜(负透镜)两大类。
当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称"焦点"，通过交点并垂直光轴的平面，称"焦平面"。焦点有两个，在物方空间的焦点，称"物方焦点"，该处的焦平面，称"物方焦平面"；反之，在象方空间的焦点，称"象方焦点"，该处的焦平面，称"象方焦平面"。
光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜则成正立实像。实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能。