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进口Cellsorter自动化单细胞分选和沉积系统原理介绍

近证明，在显微镜下观察到的培养皿中的荧光和未标记的活细胞都可以通过计算机视觉自动识别，并可以由计算机控制的微量移液器拾取。这种方法可以作为FACS常规应用到单细胞水平，具有很高的选择性。存活率和分选培养物的纯度均足以分选单个贴壁细胞。流体动力学模拟证实了实验分选效率和与正常FACS相似的细胞损伤风险。使用NE-4C神经外胚层小鼠干细胞和人原代单核细胞，我们将单细胞沉积在微小的液滴中。 CellSorter系统应用10条PCR试纸条（包含80个试管）进行循环填充。玻璃盖玻片用于测试原位细胞沉积。小滴体积小于1μl，每个细胞的速度为12秒。我们建议该系统可以容易地应用于自动分离单个细胞以进行进一步的研究，例如DNA或RNA分析。

图1 | CellSorter系统用于自动单细胞分选和沉积。左：整个系统的组件，包括配有数码相机的倒置显微镜，2D电动显微镜载物台，1D电动显微操纵器，CellSorter控制单元和注射泵。我们使用静水压力进行细胞沉积。上部：通过可旋转臂连接到微操作器的微量移液器可以从35毫米培养皿中收集细胞，并将其沉积在玻璃盖玻片上或80个PCR管中。

图2无需自动细胞沉积的CellSorter微量移液器。 （a）在典型的分选过程中，当从培养皿中捡起200个细胞时，微量移液器的路径。比例尺：100μm。 （b）控制软件的硬件仿真模块。荧光细胞由虚拟陪替氏培养皿中的绿色球表示，并由微量移液器拾取。 （c）微量移液器定位装置。玻璃微量移液器通过控制台安装在物镜上，控制台上装有一个物镜环，3个柱和3个控制台螺钉，将其保持在光轴上。微量移液器由控制台内的圆柱形支架固定，并通过螺钉拧紧。微量移液器本身将被引导进入物镜的LED​​的光照亮微量移液器的。可以使用弹簧的细螺钉手动将微量移液器的定位在物镜的焦点上。培养皿位于插入物中。 3根柱子在插入物上的3个圆孔处横跨，使显微镜载物台和培养皿能够水平移动。微量移液器的上端通过一根高速2通常闭液体阀连接到通向注射泵的软管上。从[1]开始。

图3 |分选前后细胞培养物的相衬和荧光图像。 （a，b，c，d）NE-4C，（e，f，g，h）3T3，（i，j，k，l）星形胶质细胞-小胶质细胞培养物。 （a，c，e，g，i，k）在排序之前（b，d，f，h，j，l）在排序之前，即左图显示排序之前和之后的文化。在（d，h，l）的插图中示出了起作用的微量移液器的孔。 GFP标记了一部分NE-4C细胞和所有小胶质细胞。部分3T3细胞用DiI染色。分选过程去除了软件检测到的这些荧光细胞。用白框表示在分选之前在相衬和荧光图像中检测到的细胞。 （c）中的细胞之间的直线显示了微量移液器的路径：由于与该微量移液器的内径相同的邻居比分选分辨率近50μm，因此排除了路径外的三个细胞。我们不需要在相衬图像中检测星形胶质细胞（i），因为GFP标记的小胶质细胞甚至可以从紧密附着的星形胶质细胞的非常近的位置去除，而不会干扰它们。 （i）中的框显示在面板k中检测到的小胶质细胞。比例尺：100μm。从[1]开始。

图4小图（a）显示了在物镜上的玻璃盖玻片上彼此隔开5毫米的内部带有单个NE-4C细胞的15滴培养基。液滴体积为0.74±0.03μl。单个完整细胞的相差（b）和荧光（c）图像。里面滴。分选过程后，在相衬和荧光模式下都可以检测到细小的液滴中的细胞。箭头指向液滴内的单元格。

表1：我们在5个实验中使用了被DiI标记的荧光NE-4C细胞（10μM，30分钟），总共选择了99个细胞进行分选。将细胞维持在MEM培养基中的塑料陪替氏培养皿中，该培养基中添加了10％FCS，4mM*，40μg/ ml*，0.25μg/ ml*。在经过30s*-EDTA处理后，我们在相中手动检测到细胞-对比模式。我们使用孔径为70μm，真空度为-9,050 Pa的微量移液器进行吸样，注入压力为6,050 Pa。将细胞置于玻璃盖玻片上，或通过微量操作器放入PCR管中。结果，单个细胞的液滴数目为93。我们没有在液滴中检测到多个细胞。 94±0.03％的沉积液滴包含单个细胞，而只有6±0.03％的液滴不包含细胞。