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　  集约化的畜禽和水产养殖业中,养殖废水的治理与排放已成为一项亟待解决的环境难题。净化养殖废水,降低废水的排放对环境造成的压力是促进畜禽和水产养殖业健康持续发展的重要环节。而废水中的碳、氮和磷等营养元素如能用于培养有价值的生物或转化为可直接利用的生物质,则可实现污水处理过程中营养元素的“减排”和“资源化” 。

　　微藻在生长过程中会吸收大量氮磷,在废水处理,尤其是氮磷的去除方面具有很大潜力。迄今已筛选出了许多可净化水质的藻种 ,尤以绿藻居多。同时,某些微藻在特定的培养条件下能选择性的蓄积油脂、蛋白质和色素等等,开发利用的前景广阔 。然而,微藻培养的高成本阻碍了微藻生物质、生物柴油等生产的工业化推广,于是人们纷纷将目光投向工农业废水、生活污水等含氮磷废弃物。目前,猪场养殖污水、水产养殖废水、奶牛场废水等已被证明可运用于微藻培养。这种培养方式在净化水质的同时又以废水为原料获取“新”资源和“新”能源,可谓一举多得。

　　栅藻(Scenedesmus sp. )是一种对环境污染耐受性较高的微藻品种,由于其生长速度快、脱氮除磷能力强,常被用于废水的净化。在适合的培养条件下还可获得生物柴油、蛋白质等高附加值产品。小球藻(Chlorella sp. )能适应于多种生长环境。已有学者利用改良的废水或废水原液培养小球藻,达到了环境治理和实现废水的资源化利用双重目的。

　　本文在实验室条件下考察斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)和普通小球藻(Chlorella vulgaris)在不同养殖废水中的生长情况及其对培养液中氮磷的去除效果,并检测微藻的总脂含量,旨在寻找适宜培养微藻的废水种类,以期为今后废水的深度净化、微藻生物柴油的生产提供基础资料。

　　1　实验部分

　　1. 1 实验材料

　　1. 1. 1 废水来源

　　养鸡场废水和养猪场沼液均取自合肥温氏畜牧有限公司下属养殖场。其中鸡Ⅰ废水(以下简称“鸡Ⅰ”)为鸡舍污水厌氧发酵处理后,进入*植物净化池的废水;鸡Ⅱ废水(以下简称“鸡Ⅱ”)为经*植物池净化后进入第二植物净化池的废水;猪沼废水(以下简称“猪沼”)为猪场通过清粪-沉淀池-酸化池等处理工艺流程排出的沼液经沉淀后的上清液;池塘废水(以下简称“池塘”)为本单位观赏鱼养殖池塘水。

　　上述废水经0. 45 μm 微孔滤膜过滤后,与BG-11 培养基一同经高压蒸汽灭菌后备用。为防止鸡Ⅰ原液中浓度较高的氨氮和猪沼原液中浓度较高的硝氮和总磷抑制微藻的生长,根据废水原液水质指标以及生产上节约成本的原则,实验前对上述废水原液用无菌蒸馏水进行稀释。调节各培养液pH 至7. 0 左右后,重新测定NH4+ -N、NO3- -N、TN、NO2- -N 和TP,结果见表1。

表1　废水培养液的水质指标

　　1. 1. 2 藻种来源与预培养

　　实验用斜生栅藻(FACHB-14)和普通小球藻(FACHB-31)均购*淡水藻种库。预培养条件为:环境温度25 ℃ ,光强2 400 lx,光暗比12 h∶ 12 h。培养基为经过灭菌的BG-11 培养基。

　　1. 2 实验方法

　　1. 2. 1 藻种培养

　　吸取处于对数生*的上述2 种藻种液分别接种于4 种废水培养液和BG-11 中,使得每瓶藻液初始密度均为2. 5 × 106 ind. ·mL - 1 左右,每个处理组设3 个平行。培养条件同预培养。

　　1. 2. 2 藻细胞生物量测定

　　采用细胞干重法,取一定体积的藻液,离心浓缩后冷冻干燥24 h,称重,用单位体积干重表示。所得藻粉用于总脂含量的测定。每个样品平行测定2 次。

　　1. 2. 3 水质指标测定

　　用0. 45 μm 滤膜过滤藻液,然后参照《水和废水监测分析方法(第4 版)》测定滤液中氮磷含量。氨氮测定采用纳氏试剂分光光度法,硝氮测定采用酚二磺酸分光光度法,总氮测定采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法,亚硝氮测定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法,总磷测定采用钼酸铵分光光度法。每个样品平行测定2 次。

　　1. 2. 4 总脂含量测定

　　总脂测定采用lv仿-甲醇法,每个样品平行测定2 次。

　　2　结果与分析

　　2. 1 微藻在废水中的生长情况

　　小球藻和栅藻在不同培养基中培养23 d 后,收获的藻液颜se情况如表2 所示。

表2　收获的藻液颜色

　　测定各处理组单位体积的细胞干重(见图1),结果表明,栅藻与小球藻在不同培养液中的生长情况差异很大。由表2 和图1 中可以看出,栅藻实验组中,BG-11 中收获的斜生栅藻zui多(0. 168 5 g·L - 1 ),同时在4 种废水培养液中的收获量大小依序为:猪沼> 鸡Ⅰ > 池塘> 鸡Ⅱ,尤其在后2 者中,藻液颜色变浅变黄,说明这2 种环境不利于斜生栅藻的生长。马红芳等 在水产养殖废水中培养栅藻LX1(Scenedesmus sp. LX1),至稳定期后其生物量干重可达0. 38 g·L - 1 ,说明栅藻LX1 在水产养殖废水中能较好生长,与本实验结果差距较大,分析可能是由于养殖废水种类(高密度/ 生态养殖)、预处理方法、藻种、培养条件等的差异造成的。

　　小球藻在5 种培养液中的生物量大小:猪沼> BG-11 > 鸡Ⅰ > 鸡Ⅱ > 池塘。与栅藻中情况类似,鸡Ⅱ和池塘水同样不适于小球藻的生长。但是,猪沼中的收获量(0. 353 1 g · L - 1 ) 是BG-11 中收获量(0. 189 8 g·L - 1 )的1. 86 倍。黄学平等 对小球藻、栅藻、微囊藻3 类藻在养猪废水8 种不同处理阶段的水样中进行藻生长适应性综合评价研究,结果表明,3 种藻类中小球藻生长的综合适应能力zui强,小球藻能在养猪废水中生长成为优势藻种。可见,经过一定预处理的猪沼废水作为一种资源废水应用于小球藻的培养大有前景。

　　2. 2　2 种微藻对废水水质的净化效果

　　2. 2. 1 对氨氮的去除效果

　　从图2 可以看出,栅藻对鸡Ⅰ培养液中氨氮的去除率达86. 00% ,对猪沼培养液中氨氮的去除率zui低,仅为18. 86% 。由于不同培养液中同一水质指标的初始值差异较大,因此,不能仅计算各种营养盐浓度降低的相对量,还要考查微藻对其的实际吸收量。参照培养液中氨氮的起始浓度可得知,栅藻对培养液中氨氮的去除量大小顺序是:鸡Ⅰ(8. 30 mg·L - 1 )、池塘(0. 52 mg·L - 1 )、猪沼(0. 38 mg·L - 1 )、鸡Ⅱ(0. 17 mg·L - 1 )。培养过程中栅藻显著降低了鸡Ⅰ中的氨氮含量,而对低浓度氨氮(鸡Ⅱ和猪沼等) 的去除作用却不如前者。分析造成吸收量有高低的原因可能与与溶液中硝氮的浓度有关。马红芳等和包苑榆等 的研究结果显示,斜生栅藻偏好吸收NH4+ -N。后者利用15 N 稳定同位素技术研究了斜生栅藻对氨氮和硝氮的吸收特征。结果显示: 在14 NO3- -N 和15 NH4+ -N 同时存在的混合组中,硝氮的存在,抑制了斜生栅藻对氨氮的吸收。而且硝氮浓度越高,抑制作用越大。综合表1 和图2 可以看出,鸡Ⅰ和池塘中硝氮的浓度小于氨氮,这两处理组中微藻对氨氮的吸收量较多。而其他2 组中硝氮的浓度大于氨氮浓度,且硝氮浓度越大,对氨氮的吸收量也越低,抑制作用越明显。更直接和真实的证明多种形态氮同时存在时,藻类对一种形态氮的吸收受另一种形态氮的影响。

　　各组小球藻去除氨氮的量:鸡Ⅰ(5. 25 mg·L - 1 ) > 猪沼(0. 95 mg·L - 1 ) > 池塘(0. 56 mg·L - 1 ) > 鸡Ⅱ(0. 20 mg·L - 1 )。对比2 种微藻对不同培养液中氨氮的去除率,可以发现栅藻对较高浓度氨氮(鸡Ⅰ)的去除效果好于小球藻,而小球藻对较低浓度氨氮的去除效果优于栅藻。ASLAN 等 在pH 7. 0,室温(20 ± 2)℃ ,光照为4 100 lx,氮、磷浓度比2 ∶ 1 的条件下,研究了普通小球藻对废水中氮、磷的去除效果。

　　结果表明,普通小球藻在氨态氮初始浓度为21. 2 mg·L - 1 时,对氨态氮的去除率为 。显著高于本实验中的初始浓度和去除率,这可能与实验采用的养殖废水中氮素的形态及含量不同有关,也提示我们今后可以从温度、光照、氮磷比等多方面对培养条件进行优化,提高小球藻对氨氮的吸收率。

　　2. 2. 2 对硝氮的去除效果

　　由图3 可知,在鸡Ⅱ培养液中栅藻和小球藻对硝氮的去除率zui高。猪沼培养液中,2 种微藻对硝氮的去除率低于其他组,但均在60% 以上。2 种微藻对硝氮的去除效果大致相同,去除量由大到小依次为:猪沼、鸡Ⅱ、鸡Ⅰ、池塘,均随着硝氮初始浓度的降低而减少。剩余量除猪沼组(栅藻4. 70 mg·L - 1 ,小球藻4. 74 mg·L - 1 )外,其余各组较少(0. 30 mg·L - 1 左右)。

　　由表1 可见,鸡Ⅱ和猪沼培养液中硝氮的浓度大于氨氮浓度,氨氮的抑制作用较弱,2 种微藻对硝氮的吸收利用较多。尤其在猪沼中,虽然2 种微藻的去除率都不高,但是去除的量zui多(栅藻9. 86mg·L - 1 ,小球藻9. 82 mg·L - 1 )。对于鸡Ⅰ和池塘培养液,虽然氨氮浓度大于硝氮,抑制作用强,但因其初始值很低,故而虽实际的去除量并不大但去除效率高。有研究结果显示,硝氮较适合普通小球藻的生长。因此,在硝氮含量zui高的猪沼培养液中收获的小球藻藻粉质量也zui多。对比2 种微藻对硝氮的去除率发现,栅藻对硝氮的吸收同化效果稍好于小球藻。

　　2. 2. 3 对总氮的去除效果

　　由图4 可知,小球藻和栅藻对鸡Ⅱ、猪沼和池塘培养液中总氮的去除率较高,在62. 79% ~ 84. 54% 之间,对鸡Ⅰ中总氮的去除率较低(33. 73% 和42. 86% )。结合总氮初始值,实际总氮减少量:猪沼> 鸡Ⅰ >鸡Ⅱ > 池塘,与初始值大小排序相同。认为这种结果与溶液中无机氮的含量有关。浮游植物可以直接利用水体中的可溶性无机氮,但对有机氮一般需要降解为溶解性无机氮后方可利用。实验开始时,猪沼、鸡Ⅰ、鸡Ⅱ和池塘中无机氮(氨氮、硝氮及亚硝氮等)的总量分别为19. 56、10. 38、4. 33 和2. 42 mg·L - 1 ,均超过有机氮含量,且其中又以氨氮和硝氮居多,适宜的无机氮形态和浓度有利于微藻的吸收利用,因而产生上述结果。

　　微藻去除氮的机理包括直接作用和间接作用2种方式。直接作用就是微藻对氮的去除实际上是微藻对各种无机氮和有机氮的同化作用的叠加效果。因此,总生物量(氨基酸、蛋白质)的增加抵消了培养基中部分氮素的减少。以小球藻+ 猪沼和栅藻+ 猪沼组为例,猪沼的初始总氮(32. 10 mg·L - 1 )和去除率(84. 53% 和84. 54% ) 均高于其他组,得到的藻粉质量也多(0. 353 1 和0. 131 1 g·L - 1 );而初始总氮很低的鸡Ⅱ(4. 79 mg·L - 1 ) 和池塘组(2. 71 mg·L - 1 ),既使藻体对总氮的去除率较高(62. 79% ~ 81. 15% ),收获的小球藻和栅藻藻粉仍然很少(0. 021 8~ 0. 083 0 g·L - 1 )。同时,微藻的光合作用可以使水体的pH 值升高,导致NH3 ·H2 O 以挥发的形式去除,从而间接除氮。

　　2. 2. 4 对亚硝氮的去除效果

　　由图5 可知,栅藻+ 鸡Ⅰ组和栅藻+ 鸡Ⅱ组以及小球藻+ 鸡Ⅱ组中亚硝氮的去除率均在90% 以上。此外,小球藻对鸡Ⅰ和池塘培养液中亚硝氮的去除率也在80% 以上。计算得各组亚硝氮减少总量:猪沼和池塘组> 鸡Ⅰ和鸡Ⅱ组。亚硝氮初始浓度较高的溶液中,2 种微藻对其吸收量多。而初始浓度较低的组,吸收利用率高。

　　养殖废水成分复杂,藻种对废水中不同形态氮的吸收除了与藻种(株)的内在生理特性差异、培养的环境条件有关外,还会受到培养液中其他物质成分的影响,从而导致在不同的培养时期培养液中三态氮浓度的变化趋势不同。因此,寻找适宜的培养条件增强微藻对氮的净化效果以及探索不同形态的氮之间吸收利用的相互影响等方面,尚待进一步的实验。

　　2. 2. 5 对总磷的去除效果

　　栅藻和小球藻对废水中磷的净化效果很好(见图6)。2 种微藻对鸡Ⅱ、猪沼和池塘废水中总磷的去除率均在90% 以上。对鸡Ⅰ培养液中总磷的去除率(栅藻89. 32% 和小球藻89. 48% ) 也接近90% 。

　　实验结束时,栅藻和小球藻使鸡Ⅰ和猪沼培养液中的总磷分别减少了2. 18 mg·L - 1 和4. 95 mg·L - 1 ,不但去除率高,去除量也很大。可能是2 种培养液中的磷含量均在适宜微藻生长的浓度范围内,尤其猪沼初始总磷(5. 02 mg·L - 1 )与预培养中微藻生长的BG-11 培养基磷含量相近(5. 43 mg·L - 1 ),更适于微藻生长。因此,适宜培养微藻的废水,不但其所含氮、磷种类要适于微藻生长,氮、磷浓度也要在合适的范围内。

　　与本实验结果相近的是,陈春云等 研究了小球藻对工厂化对虾养殖废水中磷的去除,磷酸盐的去除率达到了85% 以上;刘林林等 调查了多种栅藻和小球藻等对猪场养殖污水中氮磷的去除效果,发现各株微藻对污水中总磷的去除率均很高,可达91. 00% 以上。高保燕等 利用奶牛场废水培养富含油脂的尖状栅藻(S. acuminatus),该藻对磷的去除效率达到99. 4% 。可见小球藻和栅藻均是进行废水净化除磷的优良藻种。

　　2. 3 利用养殖废水培养的微藻细胞油脂含量

　　由图7 可知,收获时各藻粉样品的油脂含量均超过30% ,甚至可达到40% 以上,说明普通小球藻和斜生栅藻是潜力的产油微藻。在猪沼培养液中,小球藻油脂含量(50. 34% ) 高于BG-11 培养基(48. 26% ),而其在其他废水培养液中提取到的油脂含量则低于BG-11 培养基,说明猪沼中的成分有利于小球藻积累油脂。栅藻组中,猪沼中获得的油脂单位含量(48. 45% )与BG-11 中(48. 43% )相近,高于其他组藻粉的油脂含量。

　　氮缺乏会导致微藻油脂的积累,在缺氮的HSM 培养基中微芒藻(Micractinium pusillum Y-002)的油脂含量超过HSM 含量的10 倍以上 ,隐甲藻(Crypthecodinium cohnii) 的油脂和DHA 的含量也较高。其原因可能为氮源缺乏时,含氮元素较少的贮存脂类和绝大多数膜质仍能继续合成,导致在细胞干质量中的含量增加 。磷是构成DNA、RNA、ATP 和细胞膜的必要元素。通过对磷限制条件下海洋微藻油脂含量影响的研究发现,磷限制会导致三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、角毛藻(Chaetocerossp. )和鲁兹巴夫藻(Pavlova lutheri)的油脂含量增加,但是绿色鞭毛藻、拟球藻(Nannochloris sp. )和融合微藻(Tetraselmis sp. )的油脂含量降低 。即对于不同的藻种,磷限制导致的结果不同。与BG-11 中的氮(247 mg·L - 1 )和磷(7 mg·L - 1 )含量相比,4 种废水培养液中氮磷含量均较低,但zui终的油脂含量却没有明显降低,说明在本实验过程中,低氮、低磷条件下可获得较高的油脂含量。尤其在鸡Ⅱ和池塘培养液中,低磷浓度虽然限制了栅藻和小球藻的生长,但对微藻总脂含量的影响不显著。

　　后人对湖泊和近海处的上千种藻种的产油效率进行了分析,发现微藻油脂含量(% ,干质量) 普遍为20% ~ 50% 。在适宜的培养条件下,微藻体内油脂含量还可显著提高。CONVERTI 等 的研究表明,C. vulgaris 在25 和30 ℃ 下生长速率一样,但是在25 ℃ 生长下的藻油脂的积累速率和产量分别是后者的2. 7 和5. 0 倍。石娟等 对小新月菱形藻(Nitzschia closterium f. minutissima)和等鞭金藻(Isochrysis galbana Parke)8701 的研究发现,低光下2 种藻的脂肪含量多而高光下则相反。在对其他饵料微藻的研究中也得到了相似的结果 。可见,本实验中各培养液的营养盐条件和25 ℃ 、较低光强的环境条件适宜于微藻油脂的积累。但是在生产实际上,产油能源微藻的应用价值不仅仅体现在单位藻细胞的油脂含量,还取决于藻细胞的生物量,即微藻油脂生成总量= 藻细胞生物量× 单位藻细胞油脂含量。由此看来,猪沼培养液中的微藻生物量和细胞油脂含量均处于较高水平,具备生产能源微藻的潜力。

　　3　结论与展望

　　1)微藻在废水中的生长。在本实验条件下,栅藻在各废水培养液中的产量低于BG-11 培养基中的产量。而在猪场沼液中收获到的小球藻生物量明显高于BG-11 以及其他培养基中的生物量。

　　2)微藻对废水的净化。2 种微藻对总磷的去除效果。氨氮和硝氮对微藻的吸收存在互相干扰。栅藻对硝氮的去除率高于小球藻。

　　3)微藻细胞的油脂产量。单位质量的各组藻粉含油量均在30% 以上。猪沼培养液中,小球藻和栅藻的油脂含量高于其他组,加之同一培养条件下较高的藻粉产出,证明猪场沼液运用于培养产油微藻是可行的。

　　4)废水资源培养能源微藻,降低了废水处理以及微藻培养的成本,同时收获了微藻生物质或其高附加值产品,使废水变废为宝,减少了废水排放所带来的环境污染,有利于社会的可持续发展。今后的研究还可从以下两个方面进行:藻粉产量的提高:通过添加外源氮磷,以增加易吸收营养盐或调节培养液氮磷比的方式来达到增产的目的,但同时不能增加环境压力,使余水成为新的污染源;确定微藻的收获时间:微藻的净化效果、产量和油脂含量与微藻的生长时期密切相关,掌握合适的收获时间,可节约培养成本,更可获得zui大的综合收益。