【产品用途】

　　玉米赤霉烯酮(ZEN)免疫亲和柱适合于和HPLC、LC-MS及ZEN酶免分析试剂盒结合使用，定量检测ZEN。适用于粮食及粮食制品、食品、饲料等样本中的ZEN净化处理，提高了样品的纯度，纯化后的提取液可用不同的分析方法测定。

　　【测定原理】

　　玉米赤霉烯酮免疫亲和柱测定的基础是抗原抗体反应，抗玉米赤霉烯酮(ZEN)的单克隆抗体连接在柱内凝胶介质上，样品中的ZEN经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢通过ZEN免疫亲和柱，在免疫亲和柱内，ZEN与抗体结合，洗涤液通过免疫亲和柱除去未被结合的杂质。采用甲醇洗脱ZEN，然后进行相关分析。

　　【所需材料】(不提供)

　　(1)设备及器皿耗材：天平、粉碎机、离心机、涡旋混匀仪或摇床(转速≥200r/min);量筒、50mL玻璃漏斗、微量移液器(100μL~1000μL)、快速定性滤纸、玻璃微纤维滤纸(whatman934-AH，直径11cm，孔径1.5μm)、20mL玻璃注射器等。

　　(2)试剂：甲醇(色谱级)、乙腈(色谱级)、lv化钠、蒸馏水或去离子水。

　　【试剂配制】

　　0.1%吐温20-PBS溶液：将0.1%吐温20-PBS粉末(厂家提供)直接用900mL水全部溶解后，用HCl或NaOH调pH至7.4，用水定容至1L。

　　5M NaOH溶液：称取20gNaOH，溶于100mL水中。

　　【样品制备及净化】

　　(1)粮食及粮食制品

　　----准确称取40g(精确至0.01g)粉碎的样品，加入4glv化钠;

　　----与100mL乙腈-水溶液(9+1，v/v)混合，摇床振荡提取15min;

　　----用快速定性滤纸过滤或4000r/min，离心5min;

　　----准确移取10mL滤液或上清液，加入40mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用;

　　----准确移取10mL混匀滤液(相当于0.8g样品)过亲和柱。

　　(2)酱油、醋、酱及酱制品

　　----准确称取25g(精确至0.01g)样品到100mL容量瓶中;

　　----加入纯乙腈定容至100mL，摇床振荡提取15min;

　　----用快速定性滤纸过滤或4000r/min，离心5min;

　　----准确移取10mL滤液或上清液，加入40mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用;

　　----准确移取10mL混匀滤液(相当于0.5g样品)过亲和柱。

　　(3)酒类

　　----准确称取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样20g(精确至0.01g)样品于50mL容量瓶中;

　　----加入纯乙腈定容至50 mL，摇床振荡提取15min;

　　----用快速定性滤纸过滤或4000r/min，离心5min;

　　----准确移取10mL滤液或上清液，加入40mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用;

　　----准确移取10mL混匀滤液(相当于0.8g样品)过亲和柱。

　　(4)大豆、油菜籽及植物油

　　----准确称取40g(精确至0.01g)样品，加入4glv化钠;

　　----加入100mL乙腈-水(9+1，v/v)，摇床振荡提取15min;

　　----用快速定性滤纸过滤或4000r/min，离心5min;

　　----准确移取10mL滤液或上清液，加入40mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用;

　　----准确移取10mL混合滤液(相当于0.8g样品)过亲和柱。

　　(5)饲料原料及成品料等

　　----准确称取20g(精确至0.01g)粉碎的样品，加入4glv化钠;

　　----加入100mL甲醇-水溶液(8+2，v/v)，摇床振荡提取15min;

　　----用快速定性滤纸过滤4000r/min，离心5min，对于pH低于6.0的玉米加工副产物及饲料等的滤液或上清液，需要用 5M NaOH调pH至7.0左右;

　　----准确移取10mL滤液或上清液，加入30mL 0.1%吐温20-PBS稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤，至滤液澄清，备用;

　　----准确移取5mL混匀滤液(相当于0.25g样品)过亲和柱。

　　【亲和柱净化】

　　注意：整个纯化过程尽量不要让柱子干燥!

　　----3mL柱管取出上方堵头，减去上堵头螺纹下突出部分，插回柱子上，另一端与20mL针筒固定后使用;将1mL柱管上方堵头取出后斜剪断，然后再插回柱子上(柱管内偶见有小气泡属正常现象，不影响亲和柱的使用);

　　----准确移取上述混合滤液，注入针筒中，调节针筒压力使其以2秒/滴的速度缓慢通过免疫亲和柱;

　　----用20mL水冲洗柱子(对于酱油、醋、油类以及饲料等颜色较深的样液，先用10mL 0.1%吐温20-PBS清洗，再用10 mL 10%甲醇-水冲洗柱子，用10mL水冲洗柱子。)，流速1秒/滴，弃去流出液，直至2~3mL空气通过柱体，保证柱子内没有残余液体;

　　----准确加入2.0mL甲醇(色谱级)洗脱，流速自然重力，直至2~3mL空气通过柱体，保证柱子内没有残余液体。收集全部洗脱液，进行相关测定。

　　【检测方法】

　　IAC-HPLC法检测

　　----过有机滤膜(孔径0.22μm)后，直接HPLC测定;或在50℃下用氮气缓缓地吹至近干，加入流动相混匀，过有机滤膜(孔径0.22μm)后，参照GB 5009.209-2016或GB/T 28716-2012条件进行HPLC测定。

　　【注意事项】

　　(1)玉米赤霉烯酮对人体有害，应戴手套操作。凡接触到标样的玻璃器皿都要用5%次lv酸钠浸泡过夜。

　　(2)不要使用过有效期的免疫亲和柱。

　　(3)免疫亲和柱应在2~8℃保存。不要冷冻。

　　(4)使用前，免疫亲和柱需至少提前半小时回温至室温(25℃左右)。

　　(5)HPLC测定值、试剂盒测定值接近zui高检出值时，样本的实际含量可能大于柱容量而造成流穿，建议减少上样体积或者将样品提取液用20%甲醇-水稀释后再上样。

　　(6)称取的样品量以及提取液的体积可根据实际情况按比例调整，建议不少于10g样。

　　(7)玉米赤霉烯酮对光线敏感，因此样品及其提取液应当低温(2~8℃)、避光保存。