（一）脾细胞

1.材料

（1） 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。

（2）1640培养液

（3）2.5%FCS-1640营养液

2.操作方法

（1） 拉颈或用CO2处死小白鼠。

（2将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。

（3）把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。

（4）用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中。

（5）直立小试管3min，使大块的结缔组织下沉，把细胞悬液移入离心管中。

（6）以2.5%FCS—1640充满离心管，并以400g离心7min～10min（与此同时应开始制备骨髓细胞）。

（7）把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。

（8）重复⑹、⑺步骤。

（9）计算细胞，以台盼兰染色用相差显微镜检查，活细胞数应高于80%为合格。

（二）骨髓瘤细胞

骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。

选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致;②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外;③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,106个细胞/ml;④生长速度快，繁殖时间短。

目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO·BU·1;②SP2/0—Ag14（简称SP2）;③P2—X? ­—Ag8·6·5·3（简称653）;④FO

以653zui为常用，它是由矿物油4-甲基-15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮有抵抗力的亚系。

骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。

由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要处理。为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml 8-氮。取约1×107～6×107对数生（即培养15h～20h）的骨髓瘤细胞，在室温离心（400g）10min，沉淀以2.5%FCS—1640液再悬浮并计数。

（三）饲养细胞

在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。

1.材料

（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。

（2）11.6%蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。

2.操作方法

（1）拉颈处死小鼠。

（2）70%酒精浸泡消毒10min。

（3）用将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。

（4）用注射器将4ml 11.6%蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。

（5）1 000r/min离心10min。

（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。

（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。